Вторичный или коагуляционный гемостаз: методы исследования

Показатели конечного (III и IV) этапа свертывания крови

1. Время свертывания по Ли-Уайту.

Время свертывания крови — простейший общий коагуляционный тест, выявляющий наиболее грубые нарушения в системе свертывания крови (в норме — 8-10 мин). Удлинение времени свертывания может быть связано с выраженным дефицитом одного или нескольких факторов свертывания, избытком в крови антикоагулянтов (гепарина), гипокоа- гуляциошюй стадией ДВС-синдрома.

https://www.youtube.com/watch?v=ytcreatorsru

2. Время рекальцификации плазмы.

Определяют время свертывания плазмы после добавления к ней раствора хлорида кальция определенной концентраций (в норме — 60-120 секунд). Укорочение времени рекальцификации указывает на гиперкоагуляцию, удлинение — на гипокоагуляцию. Удлинение может быть связано с врожденным дефицитом факторов свертывания, наличием в крови антикоагулянтов и выраженным дефицитом ТФ-3.

3. Определение активированного парциального или каолинкефалинового времени

Определяется время свертывания плазмы с хлоридом кальция в условиях активации свертывания фосфолипидами (кефалин) и по контакту с чужеродной поверхностью (каолин). Нормальные показатели — 35-45 секунд.

АПТВ — высокостандартизованная коагуляционная проба, чувствительная только к плазменным дефектам свертывания, особенно к,дефициту факторов ХII, XI, IX и VIII, а также к избытку в плазме антикоагулянтов. АПТВ является базисным тестом для определения стадии ДВС-синдрома и контроля за эффективностью проводимой терапии.

4. Аутокоагуляционный тест (АКТ).

Нитратную кровь центрифугируют и разделяют на две пробирки: отдельно плазму и форменные элементы. Из форменных элементов приготавливают гемолизат-калыщевую смесь (ГКО) путем механического лизиса эритроцитов и добавления хлорида кальция. Плазму крови разливают на 10 пробирок.

Вторичный или коагуляционный гемостаз: методы исследования

В каждую пробирку с плазмой последовательно через 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 минут добавляют ГКС и отмечают время образования сгустка.

В норме АКТ на 2 минуте — 17-50 секунд, на 4 минуте — 8-25 секунд, на 6 минуте — 8-14 секунд, на 8 минуте — 7-11 секунд, на 10 минуте — 7-10 секунд (максимальная активность), на 20 минуте — 7-14 секунд, на 30 минуте — 10-18 секунд, на 40 минуте — 10-22 секунд, на 50 минуте — 12-25 секунд, на 60 минуте — 12-32 секунд.

АКТ является очень информативным и легко выполнимым в любой лаборатории тестом, позволяющим судить о состоянии как коагуляционного, так и антикоагуляционного звеньев гемостаза. До 10 мин исследования можно судить о нарастании и максимальной активности тромбопластина и тройбина в исследуемой крови. После 10 мин судят о скорости и интенсивности инактивации тромбина антитромбинами.

При дефиците факторов ХII, XI, IX, VIII, X, V и II время АКТ удлиняется. Кроме того, передозировка гепарина также удлиняет АКТ. Особенно это выявляется через 6, 8 и 10 минут. Если в крови повышается уровень АТ-III, AT-IV или значительно активируется фибринолиз, то значительно удлиняется время свертывания плазмы через 10-60 минут.

5. Определение толерантности плазмы к гепарину

Измеряется время рекальцификации плазмы при внесении в нее определенного количества гепарина (в норме — 6-13 минут).

Показания теста достаточно ценны для суждения о взаимодействии коагуляционного и антикоагуляционного механизмов свертывания крови. Считается, что толерантность характеризует устойчивость плазмы к действию гепарина. Если после введения гепарина резко увеличивается время образования сгустка, то толерантность плазмы к гепарину понижена, если, наоборот, время. образования сгустка уменьшается, то устойчивость плазмы к действию гепарина высока.

Вторичный или коагуляционный гемостаз: методы исследования

Толерантность плазмы к гепарину снижается при любом дефиците факторов свертывания, особенно факторов протромбиназного комплекса, при тромбоцитопении, после гепаринотерапии.

Повышение толерантности всегда свидетельствует о внутрисосудистом свертывании, истощении АТ-III или его врожденном дефиците.

1. Определение протромбинового времени и протромбинового индекса.

Определяют время свертывания плазмы при добавлении к ней тромбопластина (фактора свертывания III). В норме протромбиновое время (ПТВ) составляет 12-18 секунд. Протромбиновый индекс (ПТИ) вычисляется до формуле

Протромбиновый индекс в норме составляет 85-110%.

Удлинение протромбинового времени при нормальном тромбиновом времени свидетельствует о дефиците факторов протромбиназного комплекса (VII, X, V и II). При одновременном удлинении протромбинового и тромбинового времени следует, думать о накоплении в крови продуктов фибринолиза, присутствии гепарина или о гипо-, дисфибриногенемии. При системной красной волчанке это удлинение может быть связано с накоплением в крови волчаночного антикоагулянта.

2. Тест с ядом змеи эфы (эхитоксовый тест).

Введение в плазму яда эфы вызывает свертывание путем прямой активации протромбина с образованием аномального тромбина. Данный тромбин нечувствителен к гепарину и АТ-III, не активирует фактор ХIII, не вызывает ретракции кровяного сгустка. Время свертывания в эхитоксовом тесте зависит от содержания в плазме протромбина и фибриногена, а также от молекулярных особенностей. В норме свертывание происходит за 30 секунд.

Удлинение указанного теста свидетельствует о дефиците протромбина и/или фибриногена либо о качественных дефектах этих факторов.

Удлинение эхитоксового времени при нормальном тромбиновом времени и нормальном уровне фибриногена говорит о дефиците или аномалии протромбина.

Укорочение теста свидетельствует о циркуляции в крови активированных форм протромбина (ДВС-синдром, тромбообразование).

При гепаринотерапии этот тест очень удобно использовать для контроля за базисным состоянием гемокоагуляции (гепаринотерапия не влияет на время эхитоксового теста).

3. Определение уровня тромбопластина в плазме.

Уровень тканевого тромбопластина в крови определяется по активности маркерного фермента — 5′-нуклеотидазы в гепаринизированной плазме. Повышение активности этого фермента служит объективным критерием повреждения наружных клеточных мембран. Повышение активности рассматривается как маркер ДВС-синдрома, инфаркта различных органов.

1. Определение тромбинового времени.

Определяется время свертывания цитратной плазмы под влиянием тромбина. В норме время свертывания составляет 12-17 секунд.

    Удлинение тромбинового времени отмечается:

  • при гипофибриногенемии
  • избытке в плазме ПДФ (ДВС-синдром, тромбоэмболия)
  • молекулярных аномалиях фибриногена
  • наличии в плазме парапротеинов
  • резко выраженной гиперфибриногенемии
  • гипергепаринемии
  • фазе гипокоагуляции ДВС-синдрома

https://www.youtube.com/watch?v=ytdevru

Укорочение тромбинового времени наблюдается в I фазе ДВС-синдрома — фазе гиперкоагуляции.

2. Тест с ядом змеи щитомордника (анцистродоновый тест).

Яд щитомордника в отличие от тромбина трансформирует фибриноген в неполный фибрин-мономер, отщепляя от каждой молекулы лишь концевые пептиды А. Он не активирует фактор ХIII и тромбоциты, в связи с чем образуется нестабилизированный фибриновый сгусток, не способный к ретракции. Действие яда также не инактивируется AT-III и гепарином (при обычных терапевтических дозировках последнего). Свертывание крови под его действием происходит в норме за 30 секунд.

Анцистродоновый тест не меняется при гепаринизации больного и при избытке АТ-III, мало зависит от ПДФ. При ДВС-синдроме выявляет большее количество фибриногена, чем тромбиновый тест, и поэтому используется для диагностики дисфибриногенемий.

Следует подчеркнуть, что оба теста (эхитоксовый и анцистродоновый) могут быть использованы при ДВС-синдроме для количественного определения фибриногена в условиях гепаринотерапии или в фазе выраженной гипокоагуляции. По удлинению анцистродонового времени можно осуществлять контроль за лечением препаратами фибринолитического действия (стрептокиназа, урокиназа и другими).

3. Определение дефицита фактора XIII

Для нормального свертывания необходимо более 5% фактора ХIII. При этом фибрин сгустка не растворяется после добавления мочевины и инкубации. Если сгусток растворяется в течение 60-90 минут инкубации, то уровень фактора ХIII составляет 3-4% от нормы; в первые 30-60 минут — 2-3%, 10-30 минут — 1-2%, менее чем за 10 минут — до 1 %.

4. Определение количества фибриногена А

В норме уровень фибриногена крови составляет 2-4 г/л. Уменьшение концентрации фибриногена отмечается при его врожденной недостаточности (а-, гипо-, дисфибриногенемии), тяжелых заболеваниях печени, III фазе ДВС-синдрома, остром фибринолизе.

Увеличение концентрации фибриногена отмечается при инфекционных заболеваниях, острых и хронических воспалительных процессах, новообразованиях, тромбозах, тромбоэмболиях, после травм, родов, операций.

Вторичный (коагуляционный) гемостаз

Первичный гемостаз обеспечивается сосудистой стенкой, тромбоцитами и отчасти эритроцитами. Ему принадлежит ведущая роль в начальной остановке кровотечения в зоне микроциркуляции. Конечный результат — образование белого тромба.

    Свойства эндотелия:

  • синтезирует антитромбин III (АТ-III), который образует с гепарином комплекс «гепарин — АТ-III». Этот комплекс покрывает эндотелий, образуя его отрицательный заряд
  • синтезирует и выделяет на поверхность эндотелия мощный ингибитор агрегации тромбоцитов — простациклин
  • при повреждении выделяет III фактор свертывания (тканевой тромбопластин), запускающий внешний механизм гемостаза
  • при повреждении эндотелия коллаген базальной мембраны оказывает активирующее действие на ХII фактор (фактор Хагемана)
  • удаляет из кровотока активированные факторы свертывания крови
  • эндотелий способен противостоять не только давлению крови, но и умеренным внешним травмирующим воздействиям, препятствуя возникновению геморрагий вследствие своих анатомо-физиологических особенностей — ригидности, эластичности, пластичности
  • продукция фактора адгезии и агрегации тромбоцитов — фактора Виллебранда

Наряду с эндотелием в первичном гемостазе участвуют тромбоциты.

    Способности тромбоцитов

  • занимать краевое положение, тесно примыкая к эндотелию и создавая тем самым дополнительную стенку, повышая ее прочность
  • выполнять ангиотрофическую функцию, так как являются физиологическими кормильцами эндотелия
  • высвобождать вазоактивные вещества (серотонин, катехоламины, гистамин и другие)
  • приклеиваться к стенке сосуда (адгезия) и склеиваться между собой (агрегация)
  • уплотнять кровяной сгусток (ретракция) благодаря громбостенину

При повреждении стенок кровеносного сосуда тромбоциты вступают в контакт с эндотелием, в частности, с главным стимулятором адгезии — коллагеном. Тромбоциты набухают, образуют отростки и приклеиваются на участке повреждения. Параллельно адгезии протекает процесс агрегации тромбоцитов — набухание и склеивание между собой с образованием отростков и наложением агрегатов на дефект сосуда, вследствие чего гемостатическая пробка, или тромб, быстро растет. Первичный стимул к агрегации дают коллаген, катехоламины и серотонин, выделяющиеся из сосудистой стенки при повреждении.

Из тромбоцитов, подвергшихся адгезии и агрегации, активно секретируются гранулы, содержащие вещества, усиливающие процесс агрегации и формирующие вторую волну агрегации. В цитоплазме тромбоцита существует 4 вида гранул, которые содержат катехоламины, кальций, тромбоксан, тромбостенин, а также 12 эндогенных факторов.

    Эндогенные факторы тромбоцитов:

  • Фактор 1 тромбоцитов — подобен фактору V плазмы, ускоряет образование тромбина из протромбина, участвует в образовании протромбиназы
  • Фактор 2 — акцелератор тромбина — ускоряет превращение фибриногена в фибрин
  • Фактор 3 (тромбоцитарный тромбопластин) — необходим для эндогенного образования протромбиназы. Активность фактора 3 неповрежденных тромбоцитов проявляется лишь при изменении проницаемости мембран и выделяется при агрегации тромбоцитов
  • Фактор 4 — антигепариновый -.обладает выраженной анти- гепаршювой активностью, устраняя его эффект
  • Фактор 5 — агглютинабельный или свертывающийся фактор — но своим свойствам сходен с фибриногеном плазмы. Этот фактор принимает участие в агрегации тромбоцитов и способствует созданию прочного тромба
  • Фактор 6 — антифибринолитический фактор (антиплазмин)
  • Фактор 7 — антитромбопластический фактор, препятствующий образованию активной протромбиназы и замедляющий перевод протромбина в тромбин. В присутствии гепарина его антикоагулянтное действие усиливается
  • Фактор 8 — ретрактозим, благодаря которому вслед за остановкой кровотечения происходит стягивание краев раны. Этот фактор вызывает ретракцию сгустка крови в результате сокращения тромбостенина. При этом тромбоциты подтягиваются друг к другу, что, в свою очередь, приводит к сближению нитей фибрина
  • Фактор 9 — сосудосуживающий фактор тромбоцитов, или серотонин. Серотонин является весьма активным инициатором агрегации тромбоцитов
  • Фактор 10 — активатор тромбопластина
  • Фактор 11 — фибриистабилизирующий фактор — вещество, аналогичное фактору XIII свертывания
  • Фактор 12 — АДФ (аденозиндифосфат) — фактор агрегации тромбоцитов

Кроме того, для осуществления агрегационной функции очень важны мембранные гликопротеиды тромбоцитов, взаимодействующие с агрегирующими агентами.

    Основные виды гликоиротеидов:

  • гликопротеид I; состоящий из двух субъединиц — Iа и IЬ. Первая из них является рецептором фактора Виллебранда и необходима для адгезии, вторая — для тромбин-агрегации. Содержание этого гликопротеида снижено при тромбоцитопатии Виллебранда и Бернара-Сулье
  • гликопротеид II, состоящий также из двух субъединиц, необходим для всех видов агрегации и резко снижен (особенно IIb) при тромбоцитопатии Гланцманна
  • гликопротеид III необходим для большинства видов агрегации и ретракции сгустка, его содержание снижено при тромбоцитопатии Гланцманна

Первичная тромбоцитарная пробка не может надежно остановить кровотечение, особенно из крупных сосудов и сосудов с достаточно высоким давлением, поэтому тромбоцитарная пробка через определенный промежуток времени стабилизируется фибрином. Для этого включаются механизмы вторичного гемостаза — непосредственного свертывания крови.

Свертывание крови — сложный многоэтапный ферментный процесс, в котором участвуют ряд белков-ферментов, а также неферментные белки-акцелераторы, обеспечивающие взаимодействие факторов свертывания на фосфолипидных матрицах.

https://www.youtube.com/watch?v=ytcopyrightru

Перечень факторов, участвующих, в свертывании крови, и характеристика некоторых их свойств представлены в следующей таблице.

Характеристика факторов свертывания крови
Номер фактора Название фактора Содержание в крови, г/л Период полураспада в плазме Минимальный уровень, необходимый для гемостаза
I Фибриноген 2-4 3-5 дней 0,8 г/л
II Протромбин 0,1 3-4 дня 40%
III Тканевой тромбопластин ?
IV Ионизированный кальций 1,1-1,4 ммоль/л
V Проакцелерин 0,01 18-24 ч 10-15%
VII Проконвертин 0,005 4-6 ч 5-10%
VIII Антигемофильный глобулин А 0,01-0,02 12-18 ч 30-35%
IX Антигемофильный глобулин В (фактор Кристмаса) 0,003 20-30 ч 20-30%
X Фактор Стюарта-Прауэра 0,01 48-56 ч 10-20%
XI Фактор Розенталя 0,005 60 ч ?
XII Фактор Хагемана 0,03 50-70 ч менее 1%
XIII Фибринстабилизирующий фактор 0,01-0,02 около 3 дней 2-5%
Прекалликреин (фактор Флетчера) 0,05 ? менее 1%
Высокомолекулярный кининоген (фактор Фитцджеральда) 0,06 ? менее 1%

    Фазы свертывания крови:

  • Образование активной протромбиназы
  • образование тромбина из неактивного протромбина под влиянием протромбиназы
  • образование растворимого фибрина S (soluble)
  • образование нерастворимого фибрина I (insoluble)

Известно, что имеются два основных механизма запуска процесса свертывания — внешний и внутренний. Во внешнем механизме свертывание стимулируется поступлением в плазму тканевого тромбопластина (фактора III). Пусковым фактором внутреннего механизма свертывания крови является фактор ХII, активация которого происходит либо вследствие контакта крови с чужеродной поверхностью (стеклом, металлом, каолином и так далее), либо при контакте крови с субэндотелием (коллагеном) и другими компонентами соединительной ткани, что наблюдается при повреждении стенок кровеносных сосудов. Помимо этого активация фактора XII может осуществляться путем его ферментного расщепления (калликреином, плазмином и другими).

Следовательно, существуют два вида активации фактора XII:

    Виды активации фактора XII:

  • контактная (с образованием фактора ХIIа)
  • ферментная (с образованием активного фрагмента фактора XIIf)

Есть определенные качественные различия между действием фактора ХIIа (больше влияет на свертывание) и фактора Xllf (оказывает активирующее действие больше на калликреин-кининовой систему и фибринолиз), В целом же фактор XII является универсальным активатором всех плазменных протеолитических систем — свертывающей, калликреин-кининовой, фибринолитической и системы комплемента.

Как при внешнем, так и при внутреннем механизме свертывания взаимодействие и активация факторов осуществляются на фосфолипидных мембранах, играющих роль матриц, на которых факторы свертывания фиксируются, меняют свою структуру и интенсивно реагируют друг на друга. Роль таких матриц выполняют мембраны оболочек и гранул тромбоцитов (тромбоцитарный фактор 3) и сходные с ними компоненты из оболочек других клеток (эритроцитов и других).

В результате активации внутреннего и внешнего механизмов свертывания крови образуется активный протромбиназный комплекс, который в 300000 раз активнее, чем один фактор Ха. Такой комплекс, действуя на протромбин, превращает его в активный альфа-тромбин. Протеолитический фермент тромбин отщепляет от молекулы фибриногена 4 пептида, в результате чего образуется фибрин-мономер.

Фибрин-мономер сначала образует димеры, а затем превращается в фибрин-полимер, формируя волокна фибрина. Данный фибрин растворим в мочевине, в связи с чем обозначается как фибрин S (soluble). Под влиянием фактора ХIII в фибрине образуются дополнительные дисульфидные связи, что делает его нерастворимым в мочевине — фибрин I (insoluble).

1. Факторы II, VII, IX и X, а также два антикоагулянта (протеины С и S) являются К-витаминзависимыми, то есть дефицит витамина К приводит к нарушению карбоксилирования глутаминовой кислоты этих факторов в гепатоците, что лишает факторы свертывания способности превращаться в активные энзимы.

2. Ионизированный кальций является необходимым компонентом для свертывания крови, поскольку участвует в молекулярной конформации факторов свертывания в активную форму, фиксации факторов на фосфолипидных матрицах.

3. Из плазменных факторов свертывания лишь фактор VII участвует только во внешнем механизме, факторы ХII, XI, IX, VIII и прекалликреин участвуют только во внутреннем механизме активации. На факторах I, II, V и X замыкаются оба механизма свертывания.

4. Учитывая, что фактор VIII имеет большое значение для клиники, следует более детально рассмотреть его структуру и функции. Этот фактор состоит из 3 субъединиц: VIII-К, VIII-Ag, VIII-ФВ. Субъединица VIII-К — носитель коагуляционной активности — взаимодействует с фактором X и образует протромбиназный комплекс.

Субъединица VIII-Ag — носитель антигенной активности данного фактора. Субъединица VIII-ФВ содержит фактор Виллебранда (ФВ), который синтезируется и депонируется в эндотелии сосудов, вследствие чего используется в качестве маркера повреждения эндотелия, его уровень значительно увеличивается при сосудистых заболеваниях.

Паракоагуляционные тесты

Эти тесты основаны на феномене паракоагуляции — осаждении продуктов расслоения фибриногснового пула: растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), образующихся в процессе протеолитической деградации молекул фибрина (фибриногена) под действием плазмина (тромбина).

1. Определение фибриногена β (бетта-нафтоловый тест).

Если в плазме присутствует фибриноген β (фибрин-мономеры, образующиеся из фибриногена под действием тромбина и плазмина), то под действием бетта-нафтола в осадке появляются нити, гранулы или сгустки. Фибриноген β может определяться количественно (в норме не более 0,07 г/л) и качественно (в норме отрицательный). Положительным тест становится при ДВС-синдроме.

2. Этаноловый тест.

При наличии в исследуемой плазМё заблокированных фибрин-мономеров, то есть их комплексов с продуктами деградации фибрина (продуктами фибринолиза), в плазме под влиянием этанола образуется желеобразный сгусток. Положительный этаноловый тест говорит о том, что в организме идет ДВС-синдром, сопровождающийся лизисом образовавшегося фибрина.

Чаще тест бывает положительным на ранних этапах процесса и может стать отрицательным при выраженных гипофибриногенемиях (менее 0,5 г/л), а также после поглощения РФМК системой фагоцитирующих макрофагов. При волнообразном течении ДВС-синдрома в разные периоды заболевания может наблюдаться чередование положительных и отрицательных результатов теста.

https://www.youtube.com/watch?v=ytpressru

3. Протамин-сулъфатный тест.

Появление в плазме сгустка при добавлении к ней протамин-сульфата говорит о наличии в этой плазме РФМК. Тест может давать ложноположительный результат при выраженной гиперфибриногенемии (более 8 г/л). При ДВС-синдроме тест реже дает положительный результат, чем этаноловый, но нередко определяется положительным тогда, когда последний становится уже отрицательным. Поэтому эти тесты дополняют, а не заменяют друг друга.

4. Ортофенантролиновый тест (ОФТ).

ОФТ становится положительным и выявляет различное содержание РФМК при ДВС-синдроме, а также тромбозах и эмболиях. В отличие от других паракоагуляционных тестов ОФТ позволяет проводить количественный динамический контроль за содержанием РФМК в плазме, в том числе в процессе лечения. В норме уровень РФМК в плазме не превышает 0,035 г/л.

Методы исследования противосвертывающей системы

1. Определение фибринолитической активности крови (ФАК) методом лизиса эуглобулинов плазмы.

Принцип метода основан на осаждении в кислой среде и низкой температуре эуглобулиновой фракции, содержащей факторы свертывания и фибринолиза. Главным компонентом эуглобулиновой фракции является плазминоген. Время от момента образования сгустка фибрина до его растворения отражает фибринолитическую активность крови. В норме ФАК составляет 150-220 минут.

Увеличение времени ФАК (более 220 минут) свидетельствует об уменьшении фибринолитического потенциала плазмы (нарушение активации плазминогена из-за недостатка его активаторов, уменьшение количества плазминогена, замедление калликреин-кининовой активации, ингибирование фактора ХII). Увеличение времени ФАК наблюдается у больных тромбозами, тромбоэмболиями, при ДВС-синдроме III-IV стадии, у страдающих геморрагическими васкулитами, сепсисом, токсикозами беременности. Замедление лизиса отражает состояние гиперкоагуляции.

Повышение плазминового потенциала способствует ускорению лизиса эуглобулинов (менее 150 минут), так как плазминоген активируется вследствие увеличения экзогенных (стрептокиназа, стафилокиназа, урокиназа и других) активаторов. Степень активации плазмина, как правило, отражает защитную реакцию организма на угрозу образования тромбов при интенсивном внутри-сосудистом свертывании (вторичный фибринолиз) или самостоятельное включение плазминовой системы в патологический процесс под действием ее активаторов (первичный фибринолиз).

https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertiseru

2. Определение активности АТ-III

На долю АТ-III приходится около 80% всей антикоагуляци- онной активности плазмы, в связи с чем его определение имеет исключительно важное клиническое значение. Нормальные значения АТ-III — 80-120%. При ДВС-синдроме отмечается снижение уровня АТ-III. Кроме того, pro снижение может наблюдаться при наследственном (врожденном) дефиците АТ-III — первичной гематогенной тромбофилии, тромбозах, эмболиях, интенсивном лечениитепарином.

Adblock detector